Cell子刊热议:储存微生物组的“生物银行”该如何建设?
M.J. Ryan等人 2020-09-29
微生物组样本储存面临什么机遇与挑战?

编者按:

传统微生物研究通过菌种保藏来支持和保证研究的质量和可重复性,然而近年来兴起的微生物组研究领域正在改变这一切。

微生物组样本应该如何保存?什么样的微生物组样本值得保存?针对微生物组的生物银行(biobank)在建设过程中要注意哪些问题?将面临哪些挑战?

今天,我们特别编译了发表在 Trends in Microbiology 上的关于微生物组生物银行的文章。希望该文能够为相关的产业人士和诸位读者带来一些启发和帮助。

介绍

传统上,微生物学利用菌种保藏及其相关服务来支持和确保微生物研究的质量和可重复性1。然而,微生物组学的出现标志着科学方法的范式转变,即从保存单菌株培养物转向保存复杂的微生物群落,而这一转变需要进一步开发基础设施来支持。

欧盟的微生物组支持(Microbiome Support)项目评估了在这个重要研究领域中所需要的资源基础设施需求(图1)。在本文中,我们将就为什么我们需要保藏、需要保藏什么,以及所保藏的样品如何支持微生物组研究等问题发表看法。



图1|目前支持微生物组研究的欧洲和国际格局是碎片化的

生物银行和菌种保藏

微生物组是由细菌、古菌、真菌、藻类、原生生物和病毒组成的复杂动态系统,无论宿主生物体或环境如何,微生物组的形成/发挥功能的原理都是相同的。最近,重新定义微生物组的提议被提出:微生物组是指生活在给定生态系统中的微生物活动的集合2

虽然每株“保藏菌种”都是从微生物组中分离出来的微生物,但这些微生物代表的是在单一菌株条件下(axenic state)可培养的保藏组分。

德国 DSMZ 国家微生物菌种保藏中心是少数几个拥有更为广泛的可培养的微生物组样本的中心之一,包括来自拟南芥3、人类肠道微生物组4和小鼠微生物组5的菌株。

实际上,菌种保藏是一种商业运作模式,在这种模式下,微生物被培养出来用以销售和分配。尽管保藏中心可以提供“模拟的”、“合成的”和“构建的”微生物混合物来进行质量控制(QC)和产品供应,但是,对于只有有限供应来源的微生物组样品而言,这种方式不是最佳选择。

其实, “生物银行(biobank)”可以储存被“冻存(frozen)”或“固定(fixed)”以及快照(snapshot)的样本和组织。

各种机构的生物银行收集的患者粪便样本,均可供未来医疗使用,例如,AdvancingBio(美国)、OpenBiome(美国)、Stool Bank East(荷兰)、Metagenopolis(法国)和HMGU biobank(德国)。

粪菌库在样品处理流程和质量把控的升级上处于领先地位。这种经验不仅将提高供后续使用的产品质量,还能够将其传播分享给其他领域(如食品和农业)的科学家。

在农业领域,英国的 Rothamsted Sample Archive 样本库储藏着小麦谷物、稻草、土壤、牧草和肥料等样本。种子银行,例如,英国皇家植物园邱园千年种子库 Kew Millennium Seed Bank,涵盖了种子及其相关的内生菌。

菌种保藏(culture collection)能够确保微生物以最佳的方式被保存在支持“生长和供给”的可持续性模型中,而生物银行通常只是保存样本,不刻意关注所有微生物组分的活性或稳定性1。这意味着一个活体的菌种保藏中心和“生物银行”保存库之间有明确差异,尽管偶尔会有例外。

微生物群落库 Microbiota Vault(www.microbiotavault.org)的建立代表了迈向全面微生物组资源的重要的第一步。这是一份鼓励建立对人类重要的微生物库和呼吁开展国际微生物组保护工作的倡议6

保存与储藏

以最佳方式保存微生物组样本的挑战是巨大的。

研究人员应该已经意识到,微生物组的功能性和完整性在无意中就会发生根本性的改变,这是一个动态体系,会随着环境的影响和生物因素的变化而变化。在功能层面上,如果使用未优化的存储方法去除单个关键微生物组分,就可能会不可逆转地影响系统的完整性。

这是你努力保藏微生物组样本时必须考虑的问题:你要如何区分“胡须”和“心脏”,并评估单一成分在微生物组中的作用以及它与整个系统整体功能的关系?例如,当人们改变作物的品种、实践操作以及添加或消除微生物时,作物相关的最初始的微生物组会发生本质性变化。

在衡量微生物组保藏时,我们需要解答两个基本问题:① 应该保存什么?② 保存微生物组样品的最佳方法是什么?

关于为什么保藏以及保藏什么样品一直是一个存在争议的问题,这个问题的答案最终不仅将有利于提高研究质量和新微生物来源的微生物产品的生产(也可能存在商业价值),而且也能为保藏期间的农业变化、医疗操作变化和气候变化提供应对措施。同样,也有确保如益生菌等产品长期保持稳定的需求。

有时,保护整个微生物群落是具有科学价值的,例如共生菌及其宿主、根瘤菌及其土壤或所在根系、粪便样本中的肠道细菌,甚至是从自然复杂群落中获得的富集培养9

保留基因组 DNA 信息可以允许重复研究以确认结果,并确保研究的完整性和可重复性,但它只会提供即时信息,并只能为体系中存在的生物体提供证据,而无法提供采样时该生物是否(或曾经)是具有活性的或活跃的信息。

储存总 RNA 信息将允许转录组评估哪些微生物是有活性和潜在的功能性的。

因此,就目前的技术水平而言,亟需一种存储核酸、“完整的”微生物组样本,甚至是蛋白质提取物和代谢组分的方法。

样品容量是这种方法面临的一个重大挑战。储存大量土壤是不实际的,那么需要多少样品才能代表所讨论的微生物组就变得至关重要。

例如,在农业中,某一领域就包含着成千上万个局部的微生物群落。那么,究竟需要多少特定地点和时间的样本就可以提供实地及其微生物群的真实快照?在精准农业中,我们正在朝着精细化发展,并且不再依赖大范围中的几个样本。我们需要计算出可以为我们提供最合适、最精确信息的样本数量。

此外,随着时间的推移,由于处理和保藏操作,会造成微生物出现基因漂移现象。真核原代细胞系需要考虑基因漂移10。有了微生物组,基因漂移和对物种丰度的影响可能会发生得更快。

(编者注:基因漂移,又称基因漂流,基因逃逸,在群体遗传学中,基因漂移是指一个群体的遗传变异转移到另外一个群体的现象。基因漂移是生物种群间遗传多样性转移的重要机制。)

因此,评估和优化微生物组样品的保存技术以及研究低温生物学和可应用替代方案成为一个基本需求。如何开发保存 DNA 和微生物样本所需的技术,以及确定微生物组样品最佳提取方案等问题的解决最好是通过一个有针对性和相互协作的研究项目进行。

在历史上,低温保存和冷冻干燥一直是菌类和细菌储存的首选方法1,因为它们保存了生物体的基因组完整性,使其尽可能接近原始的“未保存的”野生型。然而,如果采用不理想的保存方法,即使在这些系统中,致病性和其他关键功能特性仍然可能会受到影响1

自 20 世纪 60 年代以来,低温保藏一直是储存微生物样品的“黄金准则”,但是目前关于低温保藏微生物组样品的报道却很少1

Kerckhof 等人评估了甲烷营养共培养、限氧自养硝化/反硝化生物被膜以及人体供体粪便样品的低温保藏方案,并成功保存了群落结构(不同物种的组成和丰度)和微生物组功能性11。Vekeman 和 Heylen 描述了混合群落样品的低温保藏方法,该方法是在 -80℃ 的条件下,而非超低温条件12

人们普遍认为,当样品被低温保存时,只有耐低温的细胞才能存活。这对于一个拥有多成分的微生物群落系统来说,如果低温储藏没有得到最佳的应用,就会给这个群落带来意想不到的选择性压力。保留微生物组组成和功能潜力能够使样本尽可能接近于最初从田间或宿主分离出来的状态,这是微生物组样品保藏的首要任务。

效果与质量评估

从宏基因组学13到转录组学14等多种方法已被用于评估微生物组的结构和功能。这些方法可以用来评估保存和储存方法的正确性,但每一种方法都有各自的局限性。

然而,一系列方法的结合,比如 Easterly 等人提出的方案可能是未来趋势。他们利用一种综合的、定量的宏蛋白质组学方法“metaQuantome”来揭示分类学组成和蛋白质功能在复杂微生物组(如人类口腔微生物组)中的联系15

最起码,应在保存/储存之前进行测试以确定微生物组的特征;在保存后进行测试以确保成分和功能的完整性。

建议与未来方向

为什么要保护微生物组样本以及什么样的微生物组应该被保护的问题必须从科学、经济、社会和环境角度详细地加以分析解决。考虑到不同环境中微生物组的多样性和复杂性,应该共同商定一个优先列表,以实现改进。

最大的技术瓶颈是方法的优化,这主要涉及到微生物组的保藏以及保持样品微生物组组成和功能方面是否成功的评估方法。

菌种保藏和生物银行之间存在明显的互补性,因此,需要建立相应的方法使两者可以协调工作,以确保这一关键微生物组研究领域得到有效的数据支持,而这确定基础设施的需求,以衡量欧盟内外部机构或组织需要什么、可用什么或缺失什么。

参考文献:

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1.Ryan, M.J. et al. (2019) Fungal biological resources to support international development: challenges and opportunities. World J. Microbiol. Biotechnol. 35, 139

2.Berg, G. et al. (2020) Microbiome definition re-visited: old concepts and new challenges. Microbiome 8, 103

3.Bai, Y. et al. (2015) Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota. Nature 528, 364–3694.

4.Browne, H.P. et al. (2016) Culturing of ‘unculturable’ human microbiota reveals novel taxa and extensive sporulation. Nature 533, 543–546

5.Lagkouvardos, I. et al. (2016) The Mouse Intestinal Bacterial Collection (miBC) provides host-specific insight into cultured diversity and functional potential of the gut microbiota. Nat. Microbiol. 1, 16131

6.Bello, M.G.D. et al. (2018) Preserving microbial diversity. Science 362, 33–34

7.Bell, T. (2019) Next-generation experiments linking com- munity structure and ecosystem functioning. Environ. Microbiol. Rep. 11, 20–22

8.Adams, D. (2002) The Salmon of Doubt: Hitchhiking the Galaxy One Last Time, MacMillan

9.Gich, F. et al. (2012) Enrichment of previously uncul- tured bacteria from natural complex communities by adhesion to solid surfaces. Environ. Microbiol. 14, 2984–2997

10.Geraghty, R.J. et al. (2014) Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br. J. Cancer 111, 1021–1046

11.Kerckhof, F.-M. et al. (2014) Optimized cryopreservation of mixed microbial communities for conserved functionality and diversity. PLoS One 9, e99517

12.Vekeman, B. and Heylen, K. (2015) Preservation of micro- bial pure cultures and mixed communities. In Hydrocarbon and Lipid Microbiology Protocols. Springer Protocols Handbooks (McGenity, T. et al., eds), pp. 299–315, Springer

13.Mauchline, T.H. et al. (2018) Old meets new: most probable number validation of metagenomic and metatranscriptomic datasets in soil. Lett. Appl. Microbiol. 66, 14–18

14.Bashiardes, S. et al. (2016) Use of metatranscriptomics in microbiomeresearch.Bioinform.Biol.Insights10,BBI.S34610

15.Easterly, C.W. et al. (2019) metaQuantome: an integrated, quantitative metaproteomics approach reveals connec- tions between taxonomy and protein function in complex microbiomes.Mol.Cell.Proteom.18,S82–S91


原文链接:https://www.cell.com/trends/microbiology/fulltext/S0966-842X(20)30188-8

作者|M.J. Ryan等人

编译|张砚宁

审校|617

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